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p7TP2融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及其多克隆抗体的制备和应用
作者:袁菊 成军 洪源 陶明亮 靳亚平 
单位:西北农林科技大学动物科技学院 咸阳市 712100 首都医科大学传染病学研究所 北京地坛医院 北京 100015 
关键词:p7TP2 原核表达 多克隆抗体 新基因 
分类号:
出版年,卷(期):页码:2010,2(4):1-6
摘要:

目的 应用基因芯片技术筛选获得p7蛋白反式调节的新基因,即丙型肝炎病毒(HCV)p7蛋白反式激活基因p7TP2,研究其生物学功能。方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA序列,并构建原核表达载体pET-32a(+)-p7TP2,转入大肠埃希菌Rosetta-gami B中,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在相对分子量约35 kD处有一条特异的蛋白质条带,以包涵体形式表达,并通过蛋白质变性、重折叠及纯化后得到了高纯度融合蛋白,将重组蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备抗-p7TP2多克隆抗体。结果 经酶联免疫吸附法(ELISA)测定、蛋白印迹(Western blot)和免疫组织化学鉴定,制备的多克隆抗体具有较高效价和特异性。结论 p7TP2蛋白的表达及多克隆抗体的制备为进一步研究HCV p7TP2蛋白的功能及丙型肝炎的发病机理创造了条件。

Objective To screen  the new gene p7TP2  transregulated by HCV p7 protein  through gene chip technique and  investigate  its biological  functions. Methods The p7TP2 cDNA was ampli? ed by PCR and prokaryotic expression vector pET-32a  (+)-p7TP2 was constructed by gene  recombination  techniques, which were  transformed  into E. coli Rosetta-gami B, for IPTG  induced expression. The p7TP2 fusion protein was expressed  in  the  form of  inclusion body. A band with 35 kD appeared on SDS-PAGE gel. The protein expressed by carboxyl  terminal coding  sequence had a high purity after denaturation,  refolding and purification. New Zealand  rabbits were  immunized with p7TP2  fusion protein  to prepare polyclonal antibody against p7TP2. The p7TP2 antiserun was obtained and characterized by ELISA, Western blot, immunohistochemistry. Results Results  showed  that  the polyclonal antibody had high  titer, affinity and speci? city. Conclusions The study provide a favorable  tool for further functional study of HCV p7TP2 and the pathogenesis of hepatitis C.

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